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  • 原文摘要
  • 巨噬细胞是人体重要的固有免疫细胞,根据功能可以分为经典活化的M1型和旁路活化的M2型。M1型巨噬细胞具有促炎及抗肿瘤作用,M2具有抑制炎症及促进血管增生作用。有研究表明巨噬细胞在血管瘤增生期组织中主要为M2型,促进血管增生。而在血管瘤消退期,主要是M1型,抗炎及抑制血管增生的作用。普萘洛尔是一种非选择性β-受体阻滞剂,在治疗婴幼儿血管瘤时被证明具有良好的疗效,虽然目前关于普萘洛尔治疗血管瘤的机理已经被众多学者进行了大量的研究,但是其具体机制仍然没有被阐明,目前认为普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤是通过多种途径综合起作用。<br>目的:<br>本文主要研究普萘洛尔在治疗血管瘤时,是否有促进血管瘤组织中巨噬细胞向M1分化、诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化的作用,从而加快血管瘤的退化。<br>方法:<br>1.体外培养小鼠成纤维细胞(L929),培养24小时后提取L929细胞上清液(含有M-CSF)于-20度冻存。<br>2.购买6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠两只,无菌环境下提取C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞,加入到含有20%的M-CSF的L929细胞上清液的培养基中培养7天,培养并诱导C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞分化为骨髓源性的巨噬细胞(M0型)。<br>3.将诱导成功的M0型巨噬细胞分为六祖:对照组(M0型)、LPS组(10ng/mlM1型)、IL-4组(10ng/ml M2型)、不同浓度的普萘洛尔组(0.1、1、10umol/L)、不同浓度的普萘洛尔(0.1、1、10umol/L)预处理2小时+LPS(10ng/ml)组、不同浓度的普萘洛尔(0.1、1、10umol/L)预处理2小时+IL-4(10ng/ml)组。<br>4.通过细胞形态学观察每组细胞的形态。<br>5.通过CCK-8法检测加入不同浓度的普萘洛尔对巨噬细胞增殖是否有影响,分别选取24、48、72、96小时后加CCK-8试剂,每组4个副孔,测OD值,取其平均值计算。<br>6.通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养12小时后每组细胞上清液中TNF-a、IL-10的含量。<br>7.通过Westernblot方法检测培养24小时后每组的inos,Arg-1的蛋白表达情况。<br>结果:<br>1.各组细胞在培养24小时后,对照组巨噬细胞显微镜下外观呈短梭型,边缘光滑,为M0型巨噬细胞。LPS组巨噬细胞显微镜下外观呈现蛋花样卵圆形改变,边缘有短触角。IL-4组巨噬细胞显微镜下呈现细长梭型,两端触角细长。<br>2.CCK-8法检测发现不同浓度的普萘洛尔作用巨噬细胞后,对其增殖无统计学意义(P>0.05)。<br>3.酶联免疫吸附实验(ELISA)发现与单纯LPS组对比,不同浓度的普萘洛尔(0.1、1、10umol/L)预处理2小时+LPS(10ng/ml)组的TNF-a分泌显著增加(P<0.05),组内亦呈普萘洛尔浓度依赖性增加(多重两两比较P值均<0.05),而IL-10分泌减少(P<0.05);与单纯加入IL-4组对比,不同浓度的普萘洛尔(0.1、1、l0umol/L)预处理2小时+IL-4(10ng/ml)组的IL-10分泌减少(P<0.05),而TNF-a分泌增加(P<0.05),组内呈普萘洛尔浓度依赖性增加(多均数两两比较P值均<0.05)。<br>4.Westernblot发现LPS组M1型巨噬细胞标记蛋白inos表达较对照组明显增加(P<0.05),IL-4组M2型巨噬细胞标记蛋白Arg-1表达较对照组明显增加(P<0.05),单纯加入不同浓度的普萘洛尔组较对照组inos、Arg-1均未检测出表达,在加入IL-4基础上加入不同浓度的普萘洛尔,M2型巨噬细胞的表达呈浓度依赖性减少。<br>结论:<br>普萘洛尔治疗儿童血管瘤的机制复杂,对血管瘤组织中巨噬细胞的作用可能是其中的机制之一。<br>本实验发现普萘洛尔对巨噬细胞的增殖没有影响,但是可以通过促进巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化,并且诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化,从而增加了血管瘤组织中M1型巨噬细胞的比率,抑制了血管瘤组织血管的生成,加速了血管瘤的消退。
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